Application of TRIS Buffer in Plasmid Extraction by Agarose Electrophoresis

Tris (Trihydroxymethylaminomethan) ist eine schwache Basis mit einem pKa von 8,1 bei Raumtemperatur 25°C und einem effektiven Pufferbereich von pH 7,0 ~ 9.2Der pH-Wert einer wässrigen Lösung von Tris-Alkali beträgt etwa 10.5. Salzsäure wird in der Regel hinzugefügt, um den pH-Wert auf den gewünschten Wert anzupassen, so daß der Puffer dieses pH-Wertes erhalten werden kann.Die DNA wird in einer solchen Lösung entprotoniert., wodurch die Löslichkeit verbessert wird.Wenn die pH-bereinigte Säurelösung durch Essigsäure ersetzt wird, wird ein "TAE-Puffer" (Tris/Acetat/EDTA) erhalten.während ein "TBE-Puffer" (Tris/Borat/EDTA) durch Ersatz durch Borsäure gewonnen wird.Diese beiden Puffer werden üblicherweise in Nukleinsäurelektrophorese-Experimenten eingesetzt. TAE, TBE usw., die von Tris hergestellt werden, sind die am häufigsten verwendeten Reagenzien für die DNA-Elektrophorese und TE (pH 8.0) wird hauptsächlich zur Auflösung von DNA verwendet..(TE ist eine Kombination aus Tris und EDTA.) 1MTris-HCl6.8 und 1.5MTris-HCl8.8 sind die am häufigsten verwendeten Reagenzien für SDS-PAGE.

TRIS-Reagenz

Unter den herkömmlichen Verfahren der Gentechnik ist die Agarose-Gel-Elektrophorese die am weitesten verbreitete.Identifizierung und Reinigung von DNA-FragmentenEs wird in der Regel eine horizontale Elektrophoresevorrichtung zur Elektrophorese unter einem elektrischen Feld mit konstanter Intensität und Richtung verwendet.DNA-Moleküle sind in Gel-Puffern (in der Regel alkalisch) negativ geladen und wandern in einem elektrischen Feld von negativen zu positiven Elektroden.Die Geschwindigkeit der DNA-Migration hängt von der Größe und Konformation des Moleküls ab.Der Einfluss der elektrischen Feldstärke und -richtung, der Grundzusammensetzung, der Temperatur und der eingebetteten Farbstoffeusw..

BetriebVerfahren:

1 TE-Puffer: (10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA)

Elektrophoresispuffer (50XTAE)

2 Elektrophoresepuffer (50XTAE): Tris 242g, Eis-Essigsäure 57,1 ml, EDTA (0,5mol/L pH 8,0) 100 ml

Bei Verwendung 50 Mal mit destilliertem Wasser verdünnen.

3 Probenpuffer (6X): 0,25% Bromophenolblau, 0,25% Xylenblau, 40% (W/V) Saccharose

4 STET-Puffer (pH 8,0) (8% Saccharose, 0,5% Triton, 50 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris)

1) Messen Sie 100 ml TAE-Elektrophorese-Lösung, fügen Sie 0,7 g Agarose hinzu, mischen Sie gut, legen Sie in den Mikrowellenofen, heizen Sie 3 Minuten lang und lösen Sie die Agarose vollständig auf.

2) Schließen Sie die saubere und trockene elektroforetische Platte mit sterilisiertem Gummi und versiegeln Sie den Rand mit einer kleinen Menge Agarose-Lösung.Legen Sie den Kamm und stellen Sie den Abstand zwischen der unteren Kante des Kamms und der Elektrophorese-Platte, ist in der Regel 1-2 mm geeignet.

3) Wenn die gelöste Agarose-Lösung auf etwa 50 °C abgekühlt ist, wird 5 Ml Ethidiumbromid zugesetzt und die Endkonzentration von Ethidiumbromid beträgt 1,0 m g/m L. Nach dem Mischendie Agarose-Lösung in die Elektrophorese-Platte gießen und unbewegt halten.

4) Nachdem das Gel vollständig verfestigt ist (30-45 Minuten bei Raumtemperatur), entfernen Sie sanft den Kamm, entfernen Sie das Band und legen Sie das Gel in das Elektrophoresepad.

5) Im Elektrophoreseverfahren wurde eine Elektrophorese-Lösung (1'TAE) zugesetzt, um die Agarose-Geloberfläche mit einer Elektrophorese-Lösung von etwa 1-2 mm zu bedecken.